원문링크: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.0c02922
연구 배경
자연계에 소량으로 존재하는 타가토스(tagatose)는 설탕과 유사한 단맛을 갖고 있음에도 혈당지수(GI)가 낮은 저칼로리 감미료이며, 항당뇨, 항비만, 항산화, 충치 예방 효과 등의 유익한 생물학적 효과로 인해 주목을 받고 있다. 기존에 타가토스는 주로 엘-아라비노오스 이성질화효소(L-arabinose isomerase)에 의해 갈락토스(galactose)로부터 생산되어왔다. 갈락토스는 자연에서 단독으로 존재하지 않고 포도당(glucose)과 결합한 유당 형태로 존재하는데, 유당(lactose)의 수급 및 가격이 매우 불안정하다는 제약이 있다. 따라서, 안정적인 공급 및 저렴한 가격을 갖추고 있는 과당은 유당의 이상적인 대체제로 제안되어 왔으나, 이전까지 과당으로부터 타가토스를 생산할 수 있는 효소는 발견되지 않았다.
연구 성과
본 연구팀은 과당으로부터 타가토스를 극미량 생산 수 있는 타가투로네이트 3-에피머라아제(tagaturonate 3-epimerase)라는 효소를 발견하였으며, 타가토스로의 전환을 증가시키기 위해 이 효소를 개량하는 연구를 수행하였다. 효소 활성 부위의 아미노산 상호작용 분석을 통해 과당-타가토스 전환 활성에 큰 영향을 미치는 아미노산을 찾아내었으며, 실수유발 PCR 돌연변이화법(error-prone PCR), DNA 뒤섞음(DNA shuffling) 및 포화 돌연변이화법(saturation mutagenesis)와 같은 기법들을 이용하여 과당-타가토스 전환 활성을 끌어올림으로써 새로운 효소인 타가토스 4-에피머라아제(tagatose 4-epimerase)를 개발하였다.
향후 계획
기존에 유당을 사용하는 방식을 대체하는 이상적인 타가토스 생산 경로가 마련됨으로써 과당으로부터 타가토스를 산업적 적용이 가능한 수준으로 생산에 성공였지만, 대장균을 이용한 생산으로 식품용도로 적용하기에는 아직 한계가 있다. 따라서, 추후 GRAS 미생물을 활용한 식품용도 실용화 기술을 개발할 계획이다.
Abstract
D-Tagatose, a low-calorie functional sweetener, is biotransformed from lactose via galactose. The discovery of an enzyme with 4-epimerization activity toward D-fructose to produce D-tagatose has been a major goal in the sugar industry. However, no enzymes used for the direct production of D-tagatose from D-fructose have been identified until now. Here, we identified a tagaturonate 3-epimerase from Thermotoga petrophila with latent 4-epimerization activity toward D-fructose. We developed this enzyme into tagatose 4-epimerase by increasing the 4-epimerization activity toward D-fructose using structure-based engineering, including favorable interaction analysis and active-site modifications, and random mutagenesis, including saturation mutagenesis and DNA shuffling after error-prone PCR. The developed tagatose 4-epimerase, which showed 184-fold higher 4-epimerization activity toward D-fructose than that of tagaturonate 3-epimerase, produced 213 g/L D-tagatose using d-fructose in 2 h. Our results suggest that the tagatose 4-epimerase is an alternative enzyme for D-tagatose production via a different biocatalytic route.
